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ELISA定量方法的类型和构架解析
点击次数:116 发布时间:2019-08-28

定量方法的类型和构架
采用ELISA技术进行定量的平台化方法——一般来说可以分为两类,即间接法和直接法。

间接法也称为竞争法,直接法也称双抗夹心法。

今天,我们重点为大家介绍直接法。

直接法以定量抗原为例:

首先,以与抗原有强亲和力的抗体包被固定在酶标板材上,加入抗原标准品/样品反应,再加入与抗原有强亲和力的抗体并且偶联了辣根过氧化氢酶HRP/碱性磷酸酶AP的酶联抗体反应,最后加入酶对应的底物显色,中间通过洗涤去除反应体系中未结上的试剂成分。

这样信号大小和抗原的浓度成正相关,随着反应的进行酶标板材上固定的成分由抗体,转变为抗体-抗原,最后变为抗体-抗原-酶联抗体,待测的抗原处于两个抗体之间,所以也称为双抗夹心法。

双抗夹心法有一个关键点:待检测的物质(如抗原)必须给包被抗体和酶联抗体提供两个结合位点,这两个位点可以是抗原上两个以上相同的结构位点,也可以是不同的结构位点。

一般来说,Elisa的构架由标准品,内控品,空白对照,基质对照和待测样品组成。
 

 标准品 

根据实验的具体应用方向来源,标准品可以是已知浓度的国际/国家标准品或者商业化的已知浓度的蛋白分子,也可以是自制的以其他方式定量(如紫外吸收定量)的纯度较高的蛋白分子。标准品一般为7-8个浓度点,拟合成合适的浓度-信号剂量曲线作为标准曲线进行内控品和样品的定量。

 内控品 

其中,内控品是能够长期使用的、独立分装的、特定浓度(高中低)的标准品,是监控ELISA实验在单次实验中的质量和长期的应用过程中不同批次标准品的过渡桥接。

 空白对照 

空白对照为不含标准品的标准品溶液,基质对照则为不含样品的样品溶液——两者可能是一样的成分,也可能是不同的成分,需要根据实验的具体情况进行区分,目的是确认ELISA体系中是否有非特异的交叉反应。

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